《本草纲目》从古人的经验中总结认定药物的性能和效用，修正历代本草学上的谬误，补充了修治、鉴定、民间方剂等大量内容。如延胡的止痛作用、牵牛子的下泻作用、黄芩的降热作用、三七的止血作用等，他都根据古人的经验再于临床应用中一一加以验证。李时珍以科学家的求真精神，纠正了以往本草中的若干错误。同时，《本草纲目》引用了许多著作，如《神农本草经》《春秋左传》《国语》《史记》《汉书》，郭璞的《山海经注》、郦道元的《水经注》、张华的《博物志》、贾思勰的《齐民要术》、王祯的《农书》等。李时珍的编撰工作主要分为两个阶段：

第一阶段，对药物进行分类、整理和筛选，逐步形成了系统的分类标准和编写方法。在这个过程中，李时珍始终生活在动荡的环境中，但他仍坚定地深入百姓生活，时常外出进行实地考察，采集解剖各种药材，并向百姓请教有关药材的问题。他还收集了众多珍贵的药材标本，对其进行辨析，并将其记录在册，为《本草纲目》的编写提供众多一手资料。

第二阶段，修稿定稿。李时珍在《本草纲目》的编写过程中，建立了新的药物学分类体系，并创立了医药学发展史上新的科学分类体系。他将药物进行了详细的描述和分类，共分为十五部、六十类，方便百姓日常查阅。李时珍在书中明确了药物的主要功效，从八个方面对药物知识进行了概括，并对不同药物的功效进行了深入的分析，提出了新的见解。此外，李时珍在前人基础上进行改进，绘制了一千一百余幅药物形态图像，使《本草纲目》图文并茂，帮助人们认清药物的种类和功效，方便百姓在阅读时将药物名称与种类对进行对应，也为后来的药物研究和识别提供了重要的参考。

《本草纲目》规模庞大，编著时间长，李时珍的父亲李言闻，四个儿子李建中、李建元、李建方和李建木以及弟子庞鹿门等均参与了编写，并由次子李建元和四子李建木负责绘制药物插图图例。《本草纲目》共修改了三次。万历六年（1578年）完成《本草纲目》初稿时，李时珍时年61岁。此后十年又三易其稿，创作时长前后共计四十年。万历二十一年（1593年），李时珍去世。逝世后第三年，《本草纲目》在金陵（今南京）正式刊行。